Pengenalan

Di seluruh dunia, berjuta-juta oosit telah diperolehi setiap tahun dan dikultur di makmal IVF dengan tujuan untuk menawarkan bantuan teknologi reproduktif (ART) kepada pasangan yang mengalami masalah kesuburan. Oosit manusia mempunyai dimensi sepanjang 120-160 µm dan merupakan sel yang terbesar dalam badan manusia. Dalam kes-kes ART, pelbagai oosit telah diperoleh mengikut protokol rangsangan ovari yang berlainan. Selepas prosedur pengambilan oosit, oosit memaparkan pelbagai aspek kematangan, integriti dan viabiliti. Penilaian terus terhadap tahap kematangan nuklear oosit dan ciri-ciri sitoplasma adalah dua parameter yang paling penting untuk memeriksa  oosit dan disebabkan oleh gamet wanita dikelilingi oleh kumulus dan sel-sel korona pada masa pengambilan oosit, ini menjadikannya sukar untuk dinilai. Ciri-ciri morfologi setiap oosit adalah dinilai melalui bantuan mikroskop ‘inverted’.

Untuk IVF konvensional, sel kumulus oosit adalah tidak ditanggalkan untuk mengelakkan apa-apa kecederaan kimia atau mekanikal sebelum inseminasi sperma dijalankan. Untuk ICSI, sel-sel kumulus dan korona ditanggalkan secara rutin untuk membolehkan penilaian tepat terhadap kematangan nuklear oosit, sitoplasma dan untuk memudahkan pengendalian oosit semasa prosedur suntikan sperma ke dalam oosit.

Kualiti oosit, bergantung kepada kematangan oosit, ia juga memainkan peranan penting dalam potensi perkembangan embrio. Terdapat dua jenis komponen yang menentukan kematangan – kematangan nuklear dan kematangan sitoplasma. Kedua-dua komponen ini mesti berlaku secara selaras dan konsisten. Ia secara umumnya dikatakan bahawa oosit yang berkualiti tinggi mesti melengkapkan proses kematangan nuklear (M-II oosit) dan harus mempunyai ‘zona pellucida’ yang bulat dan jelas, mempunyai ruang ‘perivitelline’ kecil yang mengandungi saiz normal badan polar pertama yang tidak berpecah-belah serta mempunyai sitoplasma yang berwarna pudar tanpa mengandungi vakuol dan retikulum endoplasmik licin.

Bagi oosit manusia, pelbagai jenis morfologi yang abnormal telah diperhatikan sama ada di dalam sitoplasma dan di luar sitoplasma. Keabnormalan oosit biasanya dikelaskan sebagai :

i)          Oosit dengan keabnormalan intrasitoplasmik,
ii)         Oosit dengan keabnormalan ekstrasitoplasmik
iii)       Oosit dengan keabnormalan dalam saiz dan bentuk

Oosit dengan keabnormalan intrasitoplasmik

Oosit MII yang abnormal dengan keabnormalan intrasitoplasmik adalah seperti :
(i)         Kehadiran badan ‘inclusion’ / badan ‘refractile’ dan badan ‘lipofuscin’
(ii)        Kehadiran vakuol
(iii)       Kehadiran retikulum endoplasmik licin (sER)
(iv)       Sitoplasma yang berbutir dan gelap

Oosit dengan keabnormalan extra-sitoplasmik

Oosit  MII yang abnormal dengan keabnormalan ekstrasitoplasmik adalah seperti :

1. Badan kutub yang besar, badan kutub yang berpecah-belah
2. ‘Zona pellucida’ yang nipis, gelap, berlapis dua, berbulu berus
3. Ruang ‘perivitelline’ yang luas
4. Serpihan di ruang ‘perivitelline’

Oosit dengan keabnormalan dalam saiz dan bentuk

Oosit MII yang abnormal dengan keabnormalan dalam saiz dan bentuk adalah seperti :

1. Oosit yang bersaiz gergasi
2. Oosit yang berbentuk bujur
3. Oosit yang sitoplasma berbentuk seperti bulan sabit/ berbentuk tidak normal

Implikasi keabnormalan oosit

Kualiti oosit adalah faktor yang mengehadkan kesuburan wanita. Adalah dipercayai bahawa perkembangan embrio sebahagian besarnya ditentukan oleh kualiti oosit. Aspek yang boleh mempengaruhi kualiti oosit boleh dibahagikan kepada morfologi, selular dan molekul. Dalam amalan IVF yang rutin, kualiti oosit kebanyakannya ditentukan oleh penampilan dan prestasi selepas persenyawaan. Penentu utama bagi perkembangan oosit ialah kematangan nuklear, rupa gelendong, saiz dan sifat-sifat sitoplasma pada oosit. Keabnormalan pada sitoplasmik oosit yang teruk seperti badan ‘lipofuscin’, vakuol, pengagregatan retikulum endoplasmik licin, butiran pusat, gelendong yang tidak normal, dan terutamanya gabungan beberapa kecacatan, akan menjejaskan potensi perkembangan dan implantasi embrio. Walau bagaimanapun, kecacatan pada ekstrasitoplasmik tidak memberi kesan kepada perkembangan embrio dan potensi implantasi (Basak et al., 1998). Morfologi oosit boleh dianggap sebagai penanda untuk meramalkan kualiti embrio dan potensi implan untuk mencapai tahap morfologi embrio yang lebih standard.

‘Lipofuscin’ / ‘refractile’ terdiri daripada campuran lipid dan bahan-bahan berbutir padat. “Mereka” boleh didapati dalam pelbagai peringkat kematangan oosit. Hanya‘lipofuscin’ yang besar, di mana lebih daripada 5 µm, adalah jelas berkaitan dengan persenyawaan yang rendah dan perkembangan blastosis yang tidak digalakkan (Otsuki et al. 2007).

Vakuol adalah membran yang mengelilingi ’inclusion’ sitoplasmik yang dipenuhi dengan cecair yang hampir sama dengan cecair ‘perivitelline’. Vakuol mungkin timbul secara spontan semasa kematangan oosit apabila badan polar pertama terbentuk (Van Blerkom, 1990), dari vesikel yang sedia ada dan berasal dari retikulum endoplasmik atau radas Golgi (El Shafie et al., 2000), atau “mereka” terbentuk selepas ICSI (Ebner et al., 2005). Vakuol muncul dalam 4% daripada oosit dan mempunyai kesan negatif ke atas persenyawaan. Kadar persenyawaan adalah tidak dikaitkan dengan nombor dan saiz vakuol yang berukuran kurang daripada 14 µm. Vakuol juga mempunyai kesan negatif ke atas pembentukan blastosis (de Sutter et al, 1996;. Ebner et al. 2005).

Kemunculan retikulum endoplasmaik licin (sER) hanya diperhatikan dalam oosit MII dan mempunyai insiden sebanyak 2%. Dalam kitaran dengan oosit yang terjejas, kekerapan boleh mencapai setinggi 25%. Pembentukan struktur ini mungkin berkait dengan tahap estradiol yang tinggi (Otsuki et al., 2004). Kadar persenyawaan untuk oosit yang terlibat adalah tidak terjejas jika tindakan penjagaan diambil dengan tidak memecahkan stuktur sER. Stuktur sER akan menyebabkan pembentukan blastosis terjejas (18%), merendahkan hasil kehamilan, menyebabkan masalah obstetrik, dan berat kelahiran yang rendah (Ebner et al., 2008, Otsuki et al., 2004).

Butiran pusat adalah ciri morfologi oosit yang diiktiraf sebagai kawasan gelap yang besar dan berbutir-butir dalam sitoplasma. Keabnormalan ini menunjukkan kematangan sitoplasmik yang teruk dan dilihat dalam 35% oosit. Butiran ini tidak mempunyai kesan ke atas kadar persenyawaan dan perkembangan atau kualiti embrio, tetapi ia berkait rapat dan menjejaskan kadar kehamilan yang berterusan dengan hanya 13% sahaja. Diagnosis mengenai genetik praimplantasi menunjukkan kadar aneuploidi sebanyak 52% pada blastomer yang berasal daripada oosit ini dan ia juga boleh menerangkan kadar pengguguran yang tinggi (Kahraman et al., 2000).

Penilaian morfologi badan polar pertama (PB) daripada segi pemecahan boleh digunakan untuk menentukan umur oosit pasca ovulasi. Badan polar yang berpecah-belah dipercayai berkait dengan kualiti embrio yang lebih rendah dan persenyawaan, blastosis, implantasi serta kadar kehamilan yang rendah (Ebner et al., 2002). Walau bagaimanapun, oleh sebab badan polar pertama mempunyai jangka hayat yang singkat, morfologi akan berubah selepas beberapa jam dikultur di luar badan. Oleh itu, penilaian morfologi badan polarr tidak boleh dianggap sebagai penanda yang boleh dipercayai dalam aspek penilaian kualiti oosit dan kebolehan perkembangan embrio (Verlinsky et al., 2003).

Ketidakseragaman saiz morfologi ‘zona pellucida’ manusia (ZP) kadang-kadang dapat diperhatikan. Ketidakseragaman saiz ZP mempunyai insiden sebanyak 2-5% bagi oosit. ZP memainkan peranan yang penting dalam persenyawaan oosit dan apabila penebalan dikesan, ia mungkin menghalang proses implan. Ia adalah penting untuk pelekatan sperma dan mencegah polispermi. Ia juga mempunyai peranan sebagai pelindung sebelum penetasan dan melindungi embrio daripada tekanan mekanikal sebelum implan. Walau bagaimanapun, beberapa kajian menunjukkan bahawa keabnormalan ekstrasitoplasmik pada oosit tidak memberi kesan kepada persenyawaan, kadar perkembangan embrio atau potensi implan (Loutradis et al., 1999).

Keabnormalan daripada segi ruang ‘Perivitelline’ adalah antara jenis morfologi yang paling penting dalam komponen ekstrasitoplasmik. Ia telah dilaporkan bahawa ruang ‘perivitelline’yang besar boleh dikaitkan dengan kekurangan daya perkembangan oosit dan perendahan kadar persenyawaan. Walau bagaimanapun, kajian gagal menunjukkan perkaitan antara saiz dan bentuk ruang ‘perivitelline’ dengan kadar persenyawaan atau perkembangan embrio.

Oosit biasanya mempunyai diameter sebanyak 155 µm. Sebahagian kecil (0.3%) daripada oosit yang diambil menunjukkan diameter kira-kira 30% lebih besar daripada oosit yang normal (lebih kurang 200 µm). Ini dipanggil oosit gergasi. Oosit gergasi yang gagal dipersenyawakan akan kelihatan sebagai diploid. Oleh itu, apabila persenyawaan berlaku, oosit gergasi kerap memaparkan tiga pronuclei. Fenomena ini dikenali sebagai ‘digynic triploid’. Zigot yang dihasil mampu membelah secara normal dan berkembang ke peringkat blastosis. Oleh kerana “mereka” mempunyai kromosom yang tidak normal, adalah dinasihatkan supaya tidak memindahkan “mereka”, terutamanya untuk mengelakkan keguguran (Rosenbusch et al., 2002).

Sebaliknya, aspek-aspek sel dan molekul yang boleh menentukan kualiti oosit belum digunakan dalam rutin harian. Oosit masih belum diperiksa sepenuhnya, tetapi mereka telah menarik dan membentuk tajuk penyelidikan yang popular. Pada masa ini, aspek-aspek sel dan molekul sedang dikaji secara intensif kerana dipercayai lebih tepat dengan objektif kecekapan oosit dan kualiti embrio berbanding dengan parameter morfologi.

Subjek yang akan diperhati dengan minat yang penuh termasuk :

1. Analisis komprehensif untuk profil ekspresi gen oosit dan sel kumulus dengan menggunakan teknologi mikroarray,
2. Konstitusi genetik dan analisis sitogenetik bagi badan polar dengan menggunakan perbandingan penghibridan genomik,
3. Analisis protein yang dikeluarkan dengan menggunakan spektrometri jisim (proteomik)
4. Penyiasatan metabolomik sebagai petunjuk kualiti oosit dalam cecair folikel dan medium kultur

Siasatan yang lebih khusus termasuk status mitokondria dan aktiviti glukosa-6 fosfat dehidrogenase l dalam oosit, apoptosis sel-sel folikel dan tahap pengalihan pertumbuhan faktor-? superfamily dalam cecair folikel (Revelli et al., 2009). Oleh kerana kebanyakan ujian ini boleh dijalankan secara tidak invasif, pendekatan yang baru ini dijangka merupakan kaedah yang ideal untuk mengenal pasti oosit yang membentuk embrio dengan kromosom yang normal dan kelahiran hidup yang tinggi, sekali gus meningkatkan kecekapan keseluruhan proses IVF. Walau bagaimanapun, semua siasatan ini adalah mahal, oleh itu ia tidak sesuai untuk semua pasangan IVF.

Rujukan:

1. Basak B, Bulent U, Aycan S,Cengiz A, Senai A, Ramazan M. Oocyte morphology does not affect fertilization rate, embryo quality and implantation rate after intracytoplasmic sperm injection. Human Reprod, 1998; vol 13; 12 3431 – 3433.
2. De Sutter P, Dozortsev D, Qian C, Dhont M. Oocyte morphology does not correlate with fertilization rate and embryo quality after intracytoplasmic sperm injection. HumReprod. 1996;11:595-597.
3. Ebner T, Moser M, Shebl O, Sommerguber M, Tews G. Prognosis of oocytes showing aggregation of smooth endoplasmic reticulum. RBMOnline 2008;16:801-807.
4. Ebner T, Moser M, Sommergruber M, Gaiswinkler U, Shebl O, Jesacher K, Tews G. Occurrence and developmental consequences of vacuoles throughout preimplantation development. Fertil Steril. 2005; 83:1635 – 1640.
5. Ebner T, Moser M, Sommergruber M, Yaman C, Pfleger U, Tews G. First polar body morphology and blastocyst formation rate in ICSI patients. Hum Reprod. 2002,17:2415-2418.
6. El Shafi e M, Sousa M, Windt ML, Kruger T. An Atlas of the Ultrastructure of Human Oocytes. A Guide for Assisted Reprouction. Parthenon, NY. 2000.
7. https://www.google.com/search.
8. Kahraman S, Yakin K, Donmez E, Samli H, Bahce M, Cengiz G, Sertyel S, Samli M, Imirzalioglu N. Relationship between granular cytoplasm of oocytes and pregnancy outcome following intracytoplasmic sperm injection. Hum Reprod. 2000; 15:2390-2393.
9. Loutradis D, Drakakis P, Kallianidis K, Milingos S, Dendrinos S, Michalas S. Oocyte morphology correlates with embryo quality and pregnancy rate after intracytoplasmic sperm injection. Fertil Steril. 1999:72:240-244.
10. Otsuki J, Nagai Y, Chiba K. Lipofuscin bodies in human oocytes as an indicator of oocyte quality. J Assist Reprod Genet. 2007; 24; 263-2670.
11. Otsuki J, Okada A, Morimoto K, Nagai Y, Kubo H. The relationship between pregnancy outcome and smooth endoplasmic reticulum clusters in MII human oocytes. Human Reprod, 2004; 19; 1591-1597.
12. Otsuki J. Intracytoplasmic morphological abnormalities in human oocytes.  J. Mamm. Ova Res. 2009: 26: 26-31.
13. Revelli A, Delle Piane L, Casano S, Molinari E, Massobrio M, Rinaudo P. Follicular fluid content and oocyte quality: from single biochemical markers to metabolomics. Reprod Biol Endocrinol. 2009; 7:40.
14. Rosenbusch B, Schneider M, Glaser B, Brucker C. Cytogenetic analysis of giant oocytes and zygotes to assess their relevance for the development of digynic triploidy. Hum Reprod. 2002;17:2388-2393.
15. Sauerbrun-Cutler M, Mario V, Andrzej B, Eric G, Daniel S, Mathew L, Martin K. Oocyte zona pellucida dysmorphology is associated with diminished in-vitro fertilization success. Journal of Ovarian Research (2015) 8:5 DOI 10.1186/s13048-014-0111-5
16. Savitha P, Ramesh Raja D, Pandiyan R.  Normal and abnormal oocytes observed during assisted reproductive technique (ART) procedures. Chettinad Health City Medical Journal. 2012.
17. Van Blerkom J. Occurrence and developmental consequences of aberrant cellular organization in meiotically mature human oocytes after exogenous ovarian hyperstimulation. J Electron Microsc Tech. 1990; 16: 324-346.
18. Verlinsky Y, Lerner S, Illkevitch N, Kuznetsov V, Kuznetsov I, Cieslak J, Kuliev A. Is there any predictive value of first polar body morphology for embryo genotype or developmental potential? RMBOnline 2003; 7:336-341.